細胞培養過程中(zhōng)的在線氧含量監測

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來源: | 作者:康森(sēn)特生(shēng)物(wù)科技 | 發布時間: 2023-12-05 | 98 次浏覽 | 分(fēn)享到:

哺乳動物(wù)細胞培養物(wù)中(zhōng)氧氣和pH的實時測量什作對于了解細胞培養物(wù)的代謝動力學非常重要訊火。SDR SensorDish Reader®雪如可根據環境條件或毒理學損傷，跟蹤細胞耗氧量的時間過程。這種類型唱數的監測對組織工(gōng)程和幹細胞研究等其他應用也有價值。

圖 1：用于在線監測24孔多培養皿中(zhōng)溶解是冷氧和pH值的SDR SensorDish® Re木快ader

SDR SensorDish® Reader（圖1）可對24孔微量滴定闆中(要銀zhōng)的氧氣和pH值進行非侵入式在費技線監測。在本研究中(zhōng)，SDR用于監測以愛著4種不同細胞密度和不同氧張力（19%O2（圖2）和7%O2（圖3））。師長此外(wài)，還評估了線粒體(tǐ)調節劑對氧氣消耗率的影響(圖4)。海些以小(xiǎo)鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）為代表性哺乳動物(wù)細胞類型務個，以羰基氰化物(wù)間氯苯腙（CCCP章花）為代謝解偶聯劑，抗黴素為電(diàn)子傳遞鍊懂頻抑制劑。

一(yī)

材料與方法

小(xiǎo)鼠胚胎成纖維細胞（MEF）細胞在具有集成氧傳感木生器（OxoDishes®）的24孔多培養皿中(zhōng)生(shēng)電購長。在标準細胞培養條件（5%CO2、35店快%濕度和37°C）下(xià)，将細胞維持在有10吧時%熱滅活胎牛血清（FBS）、1%青黴素（10000 U/m區笑l）/鍊黴素（10000µg/ml）、1%L劇那-谷氨酰胺（200mM）、1%非必需氨基酸（10mM）和1%1M HEPE拿筆S（pH 7.8）的Dulbeco改良的Eag錢是le培養基（DMEM）中(zhōng)。在所有情況下(x內慢ià)，細胞在Coy O2控制手套箱中(zhōng間跳)的1ml培養基/孔中(zhōng)生(shēng)長。在整個培養影內期間，使用SensorDish®Reader軟件按預設間隔監測培養基中(zh和拿ōng)的氧濃度。

二

細胞密度的影響

第一(yī)個實驗旨在研究細胞密度對細胞耗氧率和随服得後培養基中(zhōng)pO2水平的影響。MEF細胞以三種不同匠我的濃度(100,000;33,000;和10,000個細路近胞/cm2)以及“僅介質”控制。在接近大(dà)氣中(zhō一西ng)的氧氣水平(約為19% O2)下(xià)，每2分(fēn)鐘短鐘測量一(yī)次，持續10小(xiǎo)時。氧分(fēn)布(圖2)清是章楚地顯示了細胞密度對每個處理的氧消耗水平朋商的影響。觀察到的滞後時間< 1小(xiǎo國些)時，推測系統正在與溫度和氧氣水平平衡。在此之後，所麗電有細胞濃度都顯示出與“僅培養基”對照孔相比pO2水平的下(xià)降。最後裡計，在孵育過程中(zhōng)，與“僅培養基”控制孔的偏差與最初接種請紅的細胞數量成正比，這意味着個體(tǐ)細胞呼吸在所有測試的細胞密度下(xià)了會都是等效的。

圖2：不同密度MEF細胞培養液中(zhōng)pO2的平均水平(購雨100,000;33,000;10,00從得0和0細胞/cm2)，并暴露于約19% O2;每組N = 3

第二個實驗旨在研究低氧環境對第一(yī)個實驗中(zhōng長喝)細胞密度誘導觀察的影響。MEF細胞以三種就雨不同的濃度(100,000;33,000和10,000請街細胞/cm2)以及“僅培養基”控制，然後放(fàng)置在友這7% O2的環境中(zhōng)，每5分黃玩(fēn)鐘監測一(yī)次，持續10小(少慢xiǎo)時。氧氣分(fēn)布證實了細胞密度對每次處理的氧氣消耗水平的影響(不房圖3)。觀察到短時間的溫度平衡(<1小(xiǎo)時)，之後培明場養基中(zhōng)的剩餘氧氣被細胞以密度依賴的方式消耗也紅。即使是“僅介質”在10小(xiǎo)時後也不能在7% O2的新氧水討船平下(xià)完全平衡。然而，每次處理與“僅培養基”控制能是孔的偏差與所接種細胞的數量成正比。

圖3：不同密度MEF細胞培養液中(zhōng)pO2的平均水平(1我房00,000;33,000;10,000和0細胞/cm2)，暴露于7%文內的O2;每組N = 3

三

線粒體(tǐ)調節劑的作用

第三個實驗旨在研究特定線粒體(tǐ)調節劑對細胞耗地妹氧量和随後培養基中(zhōng)pO2水平的影響。MEF細胞以33少樹,000個/cm2的速度接種，在培養皿上粘附4小(xiǎo)時。然化能後将培養基替換為含有1µl/ml二甲亞砜(DMSO，對照物(wù))的特定培窗窗養基;10µM羰基氰化物(wù)間氯苯腙(CCCP);或10µM抗黴素。亮高然後在每個孔上加1ml礦物(wù)油，在标準培養條件下(xià)男生(5% CO2, 35%濕度，37°C, 19% O2環境)孵育音很平闆，每2分(fēn)鐘監測一(yī)次靜化，持續10小(xiǎo)時。氧譜顯示了處紙子理對細胞耗氧量水平的顯著影響(圖4)。從3到4小(快土xiǎo)時時間點的測量表明，在接受有劑量的培養基之前，處理間林的變化很小(xiǎo)。在給藥30分(fēn)鐘内，兩組之間的耗氧量曲線出現舞長了可觀察到的差異。DMSO對MEF細胞的平均氧含量變化不大(dà)。在約17南書.5% O2的條件下(xià)，形成了耗氧和吸氧之間的穩開下定狀态。抗黴素是電(diàn)子傳遞鍊絡合物(wù)III的抑制劑，可以明顯降門去低細胞的耗氧速率，使細胞處于比DMSO更高兒計的穩态。最後，CCCP(一(yī)種線粒議關體(tǐ)解偶聯劑)治療導緻細胞耗氧量明顯增近也加。

圖4：抗黴素、DMSO和CCCP作用4小(xiǎo舞飛)時時MEF細胞培養液中(zhōng)pO2的平均水平;每組N 樹算= 4

四

結論

使用SDR SensorDish® Reader，我(w文生ǒ)(wǒ)們監測了哺乳動物(wù)細胞培養物(wù)中(zhōng)的培睡很養基氧含量，并顯示了細胞密度依賴性耗氧量。在19%O2、7%O2下(做鐘xià)都能觀察到密度依賴性差異，這是一(yī)拿民個更具生(shēng)理相關性的氧氣水平影跳。另外(wài)，不含細胞的細胞培養基在7% O2條件下(xià)需要10小(下樹xiǎo)時以上才能達到平衡。因此，建議在所需的呢明氧氣水平下(xià)對培養基進行預孵育。最後，與對照組資日相比，CCCP增加了細胞需氧量，而抗黴素則減少了細胞需氧量。SDR Sens吧兒orDish® Reader可以持續快速地定店作量介質氧水平，可用于測量細胞需氧量和代謝功下用能。