在造血幹細胞/祖細胞（HSPC）培養過程不醫中(zhōng)監測實時氧氣的非侵入性方法
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作者:康森(sēn)特生(shēng)物(wù)畫街科技
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發布時間: 2023-12-27
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造血祖細胞和血管祖細胞首先在低氧環境下(xià)的早期胎盤中(zh個遠ōng)發現，胎盤含氧量異常會影響胎兒的用算生(shēng)長發育，研究氧氣濃度對胎盤生(shēng窗事)長和血管發育的影響是極其重要的。
Presens的SDR SensorDish®Reader可以在從票吧人臍帶血中(zhōng)分(fēn)離(lí)的造血幹器姐細胞/祖細胞（HSPC）培養過程中(zhōng)對體(tǐ)外(wài花喝)氧濃度進行定量。在實時監測細胞培養液中(zhōn黃車g)氧濃度的同時，檢測模拟生(shēng)理氧濃度對HSPC增路請殖、細胞周期狀态以及幹細胞表型或分(fēn)化細胞類型标志(zhì)物(wù農會)表達的影響。這項研究證明了該系統在有效模拟體(tǐ)内氧氣環境的條件下(志些xià)檢測細胞表型和功能的有效性。
HSPC在生(shēng)理氧濃度下(xià)的培養
從人臍帶血中(zhōng)分(fēn)離(lí)的CD133 HSPC細胞在窗子24孔OxoDish®中(zhōng)培養長達一(yī)周。每隔2-3天，取要動出細胞和培養液，短暫離(lí)心(150匠子0rpm；5min)，并将細胞仔細地懸浮在适當氧湖雨濃度（1%、8% 或 20%）預孵育1h的培養液中(zhō麗志ng)。在這項細胞培養研究中(zhōng)，會討低氧環境是使用插入傳統CO2培養箱(圖1)的缺氧室實個物現的。在整個孵育期内，用SDR在線監測實時氧濃度。同時，在相空相同條件下(xià)，根據測定方法，在24孔闆或6孔闆中(zhōng)培養H黑長SPC細胞。更換介質時，取出等分(fēn)試樣并使用務做計數器确定細胞數。在生(shēng)理氧濃度(1%或8%)或環境氧業玩濃度(20%)培養條件下(xià)，流式細胞儀測定DNA話東含量可用于檢測HSPC細胞周期狀态。同樣，使用凋亡試劑盒(BD)結短音合流式細胞術對細胞凋亡水平進行量化。在蛋白(bái)質水平，用多參數流式答道細胞術分(fēn)析幹/祖細胞或分(fēn)化細胞的胞外(w線些ài)标志(zhì)物(wù)的表達模式(結果未顯示)相體。
圖1：SDR用于監測HSPC培養過程中(z吧能hōng)的體(tǐ)外(wài)氧濃度，将SDR連接到計算機（B）允許在實驗期間對HSPC培關日養基中(zhōng)的氧濃度進行非侵入性實時測量。
圖2顯示了在各種氧氣環境中(zhōng)進行為期兩天的 歌花HSPC 培養期間，SDR和OxoDish®聯合測量的體自媽(tǐ)外(wài)氧分(fēn)壓。HSPC在1%O2中(z多這hōng)培養時的平均氧分(fēn)壓為10.2(±5.5)mm Hg，在謝頻8%O2中(zhōng)培養時的平均氧分(fēn)壓為65.0(±7.5)信女mm Hg。在常氧(20%O2)中(zhōng)，HSPC培養液的平均氧分術作(fēn)壓為157.9(±9.2))mm Hg。為了子拿獲得相對穩定的低氧環境，每隔24小(xiǎo)時，每小(xi購算ǎo)時更換一(yī)次大(dà)氣，持續3小子小(xiǎo)時。在高氧環境中(zhōng)，HSPC的增殖速度加從件快。HSPC生(shēng)長曲線以氧濃度依賴性方嗎得式下(xià)降，在含有1%O2的環境中(zhōng)細胞增殖最低(圖畫照3)。流式細胞儀分(fēn)析HSPC DNA你秒含量可用于分(fēn)析細胞周期狀态。這項研究的結果清楚地表明，當空妹環境中(zhōng)的氧氣濃度降低時，處于休頻飛眠狀态(如G0)或處于G1期的細胞數量顯著增加。在本實驗中(zh議體ōng)，氧濃度似乎對HSPC的凋亡沒有顯內請著影響(數據未顯示)。綜上所述，這些結果表明，當HSP從哥C在模拟體(tǐ)内環境的條件下(xià)培養時，細胞增殖下(道子xià)降，很可能是由于靜息細胞(G0)的數量增加，對細我愛胞死亡沒有任何顯著影響。本研究證實了氧濃度對幹/祖細報答胞表型和功能有一(yī)定影響的證據，并進一(yī)步輛近證實了氧在胎盤發育中(zhōng)起關鍵作用的觀點。
圖2：在含有低氧(1%或8% O2)和常氧(20% O2)的氧氣環境中(zhō身數ng)進行為期兩天實驗期間，測量的HSPC培養基的實際氧張麗得力
圖3：顯示生(shēng)理氧對HSPC細胞數量影響的飛紙生(shēng)長曲線
人類胎盤發育不同時間點的生(shēng)理氧濃度可以使用含有1%或8%的行的O2(5%CO2)兩種不同的混合氣體(t著房ǐ)精準有效地模拟。本研究中(zhōng)SDR與Presens的高林OxoDish®配合使用進行的測量提供了額外(wài)的證據，證明在大(d校少à)氣氧氣(20%O2)中(zhōng)進行的傳統細胞培養可以民計創造一(yī)個明顯的高氧環境，其氧分(fēn)壓遠高于人體(tǐ)組織中(技友zhōng)的正常pO2。在胎盤研究中(zhōng)使用年年低氧混合氣體(tǐ)與之不同的是以前的研究不包姐鐘括非侵入性、實時的氧氣監測。這項調查清楚地表明，低氧細胞培短姐養系統中(zhōng)的氧濃度處于恒定的流動中(zh道街ōng)，很難維持在生(shēng)理水平。因此，需要對實驗參數（例如細胞數量山工、培養基成分(fēn)、氣體(tǐ)置換間隔等）進行标開女準化和廣泛的測試，以确保達到并随後維持實際的生(sh木對ēng)理氧濃度。使用标準化的方案，減少了房金試驗之間的變異性。此外(wài)，SDR氧氣監測系統在整個實驗期間作去提供了關于體(tǐ)外(wài)氧氣水平的可靠數據。這項研究的重複性金他結果表明，氧濃度、細胞增殖和細胞周期狀态之間存在明顯的的媽聯系。這些結果對幹細胞/祖細胞培養和功能的意義将在未來詳刀學細研究。SDR為進一(yī)步的體(tǐ)外(藍習wài)研究打開(kāi)了可能性，在這一(快線yī)研究中(zhōng)，明确的、與生(sh書大ēng)理相關的氧濃度和穩定的細胞培養條件發揮着重要作用。此外(wài)，錯服可以根據實驗監測和改變介質變化或氧氣濃度的變化。使用該系統，可以物地及時達到研究目标，從而降低研究成本。
Timothy McKinnon1, Nelli Ba舊費al2, and Marek Zygmunt2
1Samuel Lunenfeld Research Insti可好tute, Mount Sinai Hospi是吧tal, Toronto, Canada用離
2Universitätsklinikum Gießen 可校und Marburg, Germany西謝
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